宁波大学新药技术研究院的倪锋研究员课题组致力于推动化学蛋白组学技术在生物医药中的应用。2022年7月，课题组在《Chemical Communications》杂志上发表题为“Evaluation of site-diversified, fully functionalized diazirine probes for chemical proteomic applications”（Chemical Communication, 2022, 58, 9532-9535）的研究论文，报道了多位点光亲和探针在化学蛋白组学中的潜在应用。
通过与定量化学蛋白质组学技术相结合，光亲和探针已成为配体筛选和靶点鉴定的重要工具。 一般来说，光亲和探针由母体骨架、光敏基团和报告手柄三个部分组成。近年来发展起来的最小化标签（minimalist tag）将光敏基团和报告手柄组合到一起，与母体骨架的一个位点进行偶联即可得到光亲和探针[1]。其中，双吖丙啶因其体积小、活性高而成为最常用的光敏基团。该策略降低了探针的构建难度，同时对母体分子的结构改动较小从而可以更大程度保留其生物活性，因而在化学蛋白组学领域得到广泛的应用。然而，在一些案例中发现这类探针仍然不能标记其已知靶点[2, 3]。因此，除了探针-靶点的亲和力之外，还有其他的因素显著地影响着探针的标记效率。比如，双吖丙啶在紫外光照下生成的活性卡宾可以被水淬灭。由于双吖啶在母体骨架的不同位置将影响探针与作用蛋白的亲和力以及双吖啶所处的微环境，因此本研究将该因素作为考察对象。
4-苯胺基喹唑啉是几种第一代和第二代EGFR靶向药物共有的骨架，通过将minimalist tag引入到其不同位点，得到一组多位点探针。首先研究了多位点探针在全蛋白组学尺度的作用蛋白谱。凝胶荧光成像表明不同探针的整体标记强度具有明显差异，同时有部分共同标记的明亮条带；定量质谱鉴定表明每个探针都有其独有的标记蛋白，而有12个蛋白可以被6个探针标记，调研文献发现其中部分为已知的非特异性结合蛋白。因此，相比于单个位点探针， 多位点探针策略可以捕获到到更完整的作用蛋白，同时还可以有助于排除非特异性结合蛋白。
图1：多位点探针 P1-P6 在活细胞中的作用蛋白鉴定。
得到探针作用蛋白的列表后，接着详细分析探针对EGFR 的标记情况。直接比较质谱信号强度， 发现探针P6和P4的富集能力要明显优于其他探针。体外酶活抑制实验表明，P6仍然具有较好的抑制活性，而P4则几乎完全失活，这表明P4可能并非标记到激酶结构域（kinase domain, KD）。因此进一步进行了标记位点鉴定实验，以全面分析多位点探针对原位全长EGFR的标记情况。结果表明，P4确实主要标记了EGFR 的胞外区域（extracellular domain, ECD）。意料之外的是，P6除了标记KD之外，还标记了近膜域（juxtamembrane domain, JMD）和 C端无序区域（C-tail）。文献有报道喹唑啉可以诱导EGFR进行二聚，而大量研究表明EGFR二聚过程中JMD会与KD发生相互作用，且C-tail上有多个酪氨酸自磷酸化位点[4, 5]。因此，细胞内标记事件可能主要发生在 KD/JMD 和 KD/-tail的界面。这些结果表明，探针在活细胞的标记行为是一个动态事件，受到多因素的调控。在评估探针的实用性上，与使用截短激酶结构域的体外结合或活性测定实验相比，靶点富集分析结合活细胞中的标记位点鉴定可以提供对多结构域蛋白质-蛋白质和蛋白质-药物相互作用的动态行为的更多见解。
图2 多位点探针 P1-P6 对 EGFR 的富集、抑制和标记分析
最后，还评估了多位点探针在药物脱靶靶点鉴定方面的应用。我们选择了EGFR的抑制剂Erlotinib作为模型化合物。结果表明，P4探针可以鉴定到数量远多于其他探针的脱靶靶点。常规来说，P4因丧失了对EGFR 的抑制活性，不会被用于后续试验。实际上，对于潜在脱靶靶点，我们并不能预测哪一个位点的探针是最优的，用已知靶点的结合数据来评估探针是有偏差的。因此，多位点探针对于脱靶靶点的鉴定也有应用价值。
图3 多位点探针 P1-P6应用于Erlotinib的脱靶靶点鉴定
本文全部实验工作在宁波大学新药技术研究院完成，宁大新药院为第一单位，第一作者为硕士研究生谭艳，宁波礼达先导生物技术有限公司提供了部分技术支持。傅松森博士和倪锋研究员为共同通讯作者。
参考文献
[1] Li, Z et al.,Angew Chem Int Ed Engl 2013, 52 (33), 8551-6.
[2] C. G. Parker et al., ACS Cent. Sci., 2017, 3, 1276-1285.
[3] R. T. Howard et al., ACS Chem. Biol., 2020, 15, 325-333.
[4] D. Diwanji et al., IUBMB Life, 2019, 71, 706-720.
[5] C. L. Arteaga et al., J Biol Chem, 1997, 272, 23247-23254.
